Vybavenie PCR laboratória

07 Apr 2022, 08:39 ČO JE TO PCR A AKO VYBAVIŤ PCR LABORATÓRIUM 603 views

AKO VYBAVIŤ PCR LABORATÓRIUM / VYSVETLENIE ZÁKLADNÝCH POJMOV, POPIS LABORATÓRIA; NÁVRH PRÍSTROJOV

AKO FUNGUJE PCR, QPCR A RT-PCR?

PCR v reálnom čase a reverzná transkripcia sú často skracované ako „RT-PCR“, ale nie sú to isté.1 Aby sme sa uistili, že sme vieme rozdiel, stručne načrtneme rozdiely medzi týmito skratkami – PCR , qPCR a RT-PCR – pred ďalším preskúmaním každej techniky:

PCR

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je rýchla a nenákladná technika používaná na amplifikáciu špecifických segmentov DNA. Najprv sa vzorka zahreje, aby sa DNA denaturovala (rozdelila sa na dve samostatné vlákna). Teplota sa potom zníži, aby sa umožnilo oligonukleotidom anelovať sa na špecifické segmenty jednovláknovej DNA, a potom sa opäť zvýši na optimálnu pracovnú teplotu enzýmu polymerázy, ktorý potom vytvorí komplementárnu kópiu DNA. Jedno opakovanie alebo „tepelný cyklus“ týchto krokov teoreticky zdvojnásobuje množstvo špecifickej DNA prítomnej v reakcii. V závislosti od množstva DNA prítomnej na začiatku a počtu kópií amplikónu potrebných na aplikácie po PCR sa zvyčajne vykoná 25 až 40 cyklov.

Zaujímavý fakt: Enzým polymeráza, ktorý sa bežne používa v PCR, sa nazýva Taq-polymeráza, pretože bol pôvodne izolovaný z baktérie Thermus aquaticus. Tento enzým, ktorý bol prvýkrát objavený v horúcom prameni v Yellowstonskom národnom parku v 60. rokoch 20. storočia, dokáže odolávať vysokým teplotám potrebným na denaturáciu DNA.

QPCR

qPCR, tiež nazývaná real-time PCR, kvantitatívna PCR alebo kvantitatívna real-time PCR, je technika používaná na detekciu a meranie amplifikácie cieľových nukleových kyselín počas ich produkcie. Na rozdiel od konvenčných PCR, qPCR vyžadujú fluorescenčne značenú oligonukleotidovú sondu a termocykler schopný merať fluorescenciu a vypočítať prahovú hodnotu cyklu (CT). Fluorescencia sa zvyčajne zvyšuje priamo úmerne s koncentráciou vytvoreného produktu PCR, čo umožňuje meranie cieľových množstiev v reálnom čase.

RT-PCR

Reverzná transkripčná PCR (RT-PCR) sa používa na amplifikáciu cieľových sekvencií RNA, ako sú messenger RNA a vírusové RNA genómy. Tento typ PCR zahŕňa počiatočnú inkubáciu vzorky RNA s enzýmom reverznej transkriptázy a DNA primerom (sekvenčne špecifickým, oligo dT alebo náhodným hexamérom) pred PCR amplifikáciou.

Skratka RT-PCR sa niekedy používa aj pre real-time PCR skôr než pre reverznú transkripčnú PCR. Navrhujeme, aby sa real-time PCR skrátila ako qPCR, keďže real-time PCR sa tiež nazýva kvantitatívna PCR alebo kvantitatívna PCR v reálnom čase.

PCR reakcie sú veľmi citlivé a vytvárajú veľké množstvo kópií nukleových kyselín z nepatrného množstva východiskového materiálu. To z nich robí základnú a vysoko účinnú techniku molekulárnej biológie. Keďže je však náchylný ku kontaminácii amplikónom a vzorkou, plánovanie a navrhovanie priestorov vášho laboratória PCR bude potrebné dôkladne zvážiť.

Navrhnutie vášho PCR laboratória

V ideálnom prípade by PCR laboratórium malo mať dve miestnosti s dvoma oblasťami, z ktorých každá je určená na špecifické úlohy. Prvá miestnosť by sa mala používať výlučne na činnosti pred PCR a mala by byť rozdelená na oblasť prípravy hlavnej zmesi a oblasť na prípravu vzorky. Tlak vzduchu by mal byť mierne pozitívny, aby sa zabránilo prúdeniu aerosólov.

Druhá miestnosť by mala mať vyhradený priestor na amplifikáciu nukleovej kyseliny a ďalšia na analýzu produktu. Tlak vzduchu by mal byť mierne negatívny, aby sa zabezpečilo, že amplikónové aerosóly neopustia miestnosť.

Ak vám chýba priestor alebo rozpočet na dvojizbové PCR laboratórium , môžete nastaviť pred-PCR a oblasti amplifikácie a analýzy v rovnakej miestnosti, ale uistite sa, že sú od seba čo najďalej.

Mať pred-PCR aktivity priestorovo oddelené od amplifikačnej a analytickej oblasti – buď v rôznych miestnostiach alebo v samostatných laviciach – je veľmi dôležité, pretože zvyčajne máte nízke množstvo vzorky nukleovej kyseliny počas prípravy a veľmi vysokú koncentráciu po amplifikácii. To znamená, že ak analyzujete svoju PCR v rovnakom priestore, ako pripravujete hlavnú zmes a vzorky, môžete získať falošne pozitívne výsledky v dôsledku kontaminácie amplikónom.

Mali by ste sa tiež uistiť, že nastavenie vášho laboratória sa riadi jednosmerným pracovným postupom. Žiadne materiály ani reagencie používané v oblastiach amplifikácie a analýzy by sa nikdy nemali dostať do priestoru pred PCR bez dôkladnej dekontaminácie. To znamená, že pre každú oblasť budete potrebovať špeciálne vybavenie, napr. dve rôzne sady pipiet. Tento jednosmerný pracovný postup by sa mal vzťahovať aj na zamestnancov laboratórií. Ak ste pracovali v oblasti amplifikácie a analýzy a potrebujete sa vrátiť do oblasti pred PCR, vymeňte si osobné ochranné prostriedky, pretože mohli byť kontaminované aerosólmi amplikónov.

Ďalším preventívnym opatrením, ktoré treba vziať do úvahy pri zriaďovaní laboratória PCR, je okrem priestorového oddelenia aj dočasné oddelenie. Môžete napríklad zvážiť nastavenie reakcií PCR ráno a kroky amplifikácie a analýzy vykonať popoludní. To môže obmedziť vašu flexibilitu, ale zabráni problémom s kontamináciou a nutnosti opakovať experiment.

TYPY PRE PCR

PCR Laboratóriá zvyčajne vyžadujú rôzne vybavenie, ako sú odstredivky, vortexové mixéry, pipety, chladničky a mrazničky, cykléry a analytické prístroje (napr. elektroforézne systémy). V závislosti od veľkosti vášho laboratória a vašich aplikácií sa množstvo vybavenia, ktoré budete potrebovať, môže líšiť. Namiesto toho, aby sme vám poskytli „nákupný zoznam“, načrtneme, čo by ste mali hľadať pri nákupe vybavenia a spotrebného materiálu, aby ste znížili kontamináciu vašich reakcií PCR na minimum.

VYBAVENIE

3.1 Laminárny prietok alebo BIOHAZARD A2

Keďže si nikdy nemôžete byť 100 % istí, že vo vašom priestore pred PCR sa nenachádzajú žiadne aerosóly s amplikónmi, mali by ste svoje reakcie PCR nastaviť v digestore s laminárnym prúdením alebo v biologickej bezpečnostnej skrini nazývanej BIOHAZARD A2, dekontaminované bieliacim roztokom pred začatím a po dokončení práce.

3.2 Pipetové špičky a iný spotrebný materiál

Napriek tomu, že sú drahšie ako bežné pipetové špičky, používanie filtračných špičiek pre nastavenie PCR zabráni vniknutiu aerosólov do vašej pipety a ich kontaminácii a zabráni tomu, aby aerosóly, ktoré už môžu byť prítomné vo vašej pipete, kontaminovali vašu hlavnú zmes alebo vzorky. Aby ste minimalizovali spotrebu filtračnej špičky, najskôr naplňte všetky svoje skúmavky základnou zmesou s použitím iba jednej špičky alebo sady špičiek – ak používate viackanálové pipety – a pokračujte so vzorkami s použitím jednej špičky na vzorku. Odporúča sa pridať vzorku ako poslednú, pretože je jednoduchšie dávkovať ju do kvapaliny ako do prázdnej skúmavky a pretože znižuje riziko aerosólovania vzorky pri pipetovaní. Naučte sa najlepšie postupy pri pipetovaní, aby ste zabránili tvorbe aerosólu.

Pokiaľ ide o spotrebný materiál, mali by ste sa uistiť, že máte vo svojom laboratóriu k dispozícii dostatok malých fľaštičiek, keď vám doručia reagencie PCR. Ak ich alikvótujete do menších nádob, predĺžite ich trvanlivosť a zabránite tomu, aby prešli príliš veľkým počtom cyklov zmrazovania/rozmrazovania. Ak sa vaše reagencie kontaminujú, ušetrí vám to aj vyhodenie celej zásoby, pretože budete mať k dispozícii čisté alikvóty na druhú PCR.

Nakoniec sa musíte uistiť, že všetok spotrebný materiál a vybavenie neobsahujú inhibítory DNázy, RNázy a PCR. Vždy si vyberajte sterilné produkty od výrobcov, ktorí môžu potvrdiť, že ich hroty a spotrebný materiál neobsahujú žiadne z týchto potenciálnych kontaminantov.

4 ČISTENIE A KONTROLA KONTAMINÁCIE

Pri nastavovaní laboratória si nebudete musieť robiť starosti s čistením alebo kontrolou kontaminácie, ale keď je laboratórium v prevádzke, budete sa musieť starať. Tejto téme sa stručne budeme venovať nižšie.

Či už sa rozhodnete nastaviť svoje PCR reakcie v digestore s laminárnym prúdením, biologickej bezpečnostnej skrini alebo na otvorenom stole, budete musieť dekontaminovať svoj pracovný priestor pred a po nastavení tak, že ho utriete čerstvo vyrobeným bieliacim roztokom a destilovanou vodou. Rovnaký proces by sa mal vykonať v oblasti amplifikácie a analýzy. Mali by ste sa tiež uistiť, že pravidelne čistíte svoje pipety, vybavenie, kľučky dverí a rukoväte vašich chladničiek a mrazničiek.

Pretože testy PCR sú také citlivé, všetky tu opísané preventívne opatrenia nemusia zaručiť, že vaše experimenty nebudú nikdy kontaminované. Preto je potrebné zahrnúť vhodné kontroly na včasné zistenie kontaminácie. Vždy zahrňte negatívne a pozitívne kontroly, pretože to pomôže identifikovať kontaminácie hlavnej zmesi a potvrdiť výkon extrakčného protokolu, činidiel a krokov amplifikácie. Okrem toho by ste mali monitorovať mieru pozitivity vo svojom laboratóriu a zabezpečiť, aby neočakávané zvýšenie detekcie malo identifikovateľné príčiny, napr. sezónne prepuknutie.